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貝克曼庫爾特 | 生物反應(yīng)器可以進(jìn)行細(xì)胞裂解、應(yīng)激及毒性篩選的測(cè)定嗎
微生物反應(yīng)器的主要功能是模擬微生物生長(zhǎng)或生產(chǎn)的自然環(huán)境，通過生化反應(yīng)或微生物自身的代謝獲得目標(biāo)產(chǎn)物。
那么，它可以被用來進(jìn)行細(xì)胞裂解、細(xì)胞應(yīng)激及細(xì)胞毒性篩選的測(cè)定嗎？由于這類實(shí)驗(yàn)通常樣品量比較大，或者需要離線檢測(cè)，又或者需要為此重新配置設(shè)備，同時(shí)人力和實(shí)驗(yàn)成本也相當(dāng)高等等。也許你會(huì)覺得不太可能。
但是，貝克曼庫爾特的新技術(shù)BioLector XT高通量微型生物反應(yīng)器卻可以做到。
BioLector XT高通量微型生物反應(yīng)器
BioLector進(jìn)行細(xì)胞裂解、應(yīng)激及毒性篩選的測(cè)定：
PI是一種多功能染料，常用于鑒別細(xì)胞群中的死細(xì)胞，并在多色熒光技術(shù)中用作復(fù)染劑。它僅能穿透細(xì)胞膜破裂的死細(xì)胞，嵌入細(xì)胞脫氧核糖核酸（DNA）后釋放紅色熒光，而不能穿透細(xì)胞膜完整的活細(xì)胞。
BioLector結(jié)合 PI 染色法進(jìn)行細(xì)胞裂解、細(xì)胞應(yīng)激及毒性篩選的具體應(yīng)用。
方法
大腸桿菌培養(yǎng)：采用 BioLector進(jìn)行大腸桿菌 Bl21（DE3）菌種培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度 37° C，振搖速度 800 rpm），微孔板為 BOH2 型 FlowerPlate® 微孔板（MTP），每孔填樣體積為800µL。培養(yǎng)基為緩沖液濃度為 50 mM 或 200 mM 的 Wilms-MOPS。
PI 濃度：將 1mM PI 染色液溶于磷酸鹽緩沖液中配制 PI 原液。此原液需無菌過濾并在 4° C 下儲(chǔ)存。PI 嵌入 DNA 時(shí)，為避免對(duì)用戶造成傷害，培養(yǎng)基中的最終 PI 濃度不應(yīng)過高。在本應(yīng)用指南中，培養(yǎng)基最終 PI 濃度應(yīng)為 5 µM。
誘導(dǎo)細(xì)胞死亡：在此培養(yǎng)案例中，通過在 7 小時(shí)后將培溫度提升至 50°C或加入純甲醇（MeOH）來誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
測(cè)定死亡細(xì)胞：誘導(dǎo)細(xì)胞死亡后，PI 滲入細(xì)胞膜破裂的細(xì)胞與 DNA 結(jié)合，導(dǎo)致熒光偏移，然后通過PI 濾光片模塊檢測(cè)死亡細(xì)胞的熒光信號(hào)。
結(jié)果
細(xì)胞毒性篩選：采用 BioLector 進(jìn)行PI 染色和檢測(cè)進(jìn)行細(xì)胞毒性篩選。添加 MeOH 對(duì)大腸桿菌 BL21（DE3）進(jìn)行應(yīng)激培養(yǎng)，如下圖所示。
不同濃度的MeOH作為應(yīng)急因素對(duì)大腸桿菌培養(yǎng)的細(xì)胞毒性篩選
培養(yǎng) 7 小時(shí)后，添加 27%v/v MeOH 時(shí)生長(zhǎng)停滯，可通過散射光信號(hào)和 DO 信號(hào)檢測(cè)得出：添加 MeOH 后 DO 信號(hào)立即增至初始值（100 %），表明細(xì)胞開始凋亡。添加 9%v/v MeOH 導(dǎo)致散射光信號(hào)減弱，表明生長(zhǎng)斜率下降與 DO 信號(hào)相呼應(yīng)。18 小時(shí)后，添加 27%v/v 和 9%v/v MeOH 的細(xì)胞最終 PI 信號(hào)分別為 2.54 a.u. 和 1.57 a.u.。該結(jié)果對(duì)5µM PI培養(yǎng)基進(jìn)行了空白扣除。
細(xì)胞裂解的測(cè)定：如圖所示，培養(yǎng) 7 小時(shí)后，將溫度從 37° C 提升至 50°C 以誘導(dǎo)細(xì)胞裂解。散射光信號(hào)表明，經(jīng) 5 µM PI 處理的大腸桿菌未進(jìn)一步生長(zhǎng)，熱處理 1 小時(shí)后對(duì)照組也未進(jìn)一步生長(zhǎng)。未經(jīng)熱處理大腸桿菌（+ 5µM PI）的生長(zhǎng)曲線顯示，細(xì)菌在 11 小時(shí)前呈指數(shù)增長(zhǎng)，之后進(jìn)入穩(wěn)定期。熱處理后大腸桿菌停止生長(zhǎng)，2 小時(shí)后，細(xì)胞開始裂解，因此 PI 信號(hào)呈線性增強(qiáng)，并約在培養(yǎng) 14 小時(shí)后達(dá)到飽和。之所以延遲 2 小時(shí)，是因?yàn)闊崃吭谝后w中分布并作用于細(xì)胞需要時(shí)間。未經(jīng)熱處理組的 PI 曲線在指數(shù)生長(zhǎng)期可觀察到背景熒光信號(hào)。
采用BioLector 通過 PI 染色測(cè)定細(xì)胞裂解
應(yīng)激細(xì)胞測(cè)定：在正在進(jìn)行的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，散射光和 PI 信號(hào)的結(jié)合有助于識(shí)別應(yīng)激細(xì)胞。在以下案例中，大腸桿菌BL21 分別在兩種不同 MOPS 緩沖液濃度的 Wilms-MOPS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。下圖表示散射光、DO 信號(hào)、pH 值和 PI 信號(hào)隨培養(yǎng)時(shí)間變化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。更多解析請(qǐng)見應(yīng)用指南《利用BioLector進(jìn)行細(xì)胞死亡的測(cè)定》。
采用 BioLector通過 PI 測(cè)量應(yīng)激細(xì)胞
從上述應(yīng)用可以看到貝克曼庫爾特 BioLector高通量微生物反應(yīng)器，不僅可以進(jìn)行48個(gè)樣品的高通量發(fā)酵，同時(shí)在線參數(shù)檢測(cè)、補(bǔ)料和PH調(diào)控，從而實(shí)現(xiàn)高通量菌種篩選和工藝優(yōu)化，而且結(jié)合 PI 染色法可以進(jìn)行細(xì)胞裂解、細(xì)胞應(yīng)激及毒性篩選的測(cè)定。
