貝克曼庫(kù)爾特｜NGS核酸純化之洗脫篇：用啥洗？加多少？洗多久？加熱嗎？

貝克曼庫(kù)爾特基于SPRI技術(shù)的AMPure XP及SPRIselect兩種NGS文庫(kù)純化和片篩試劑。該技術(shù)采用順磁性的磁珠、選擇性的結(jié)合特定大小的核酸，被眾多主流建庫(kù)試劑盒及測(cè)序?qū)＜?/span>選用。

那么，“金標(biāo)準(zhǔn)"還有優(yōu)化的空間嗎？讓原廠來(lái)給您專(zhuān)業(yè)的分析：?jiǎn)螐南疵摚心男﹥?yōu)化的重點(diǎn)。

用什么洗？

如上圖所示: 在Tris or TE buffer (+/-EDTA)中，洗脫得率相比于純水有了顯著提升。而PBS溶液（pH 6-8）的效果緊隨其后，且PH無(wú)顯著影響。這可能與PBS中的鹽離子的存在有關(guān)。另一方面，從穩(wěn)定性（CV）上看，Tris\TE\PBS洗脫都優(yōu)于水。

加多少？

如上圖所示：對(duì)比了不同加樣體積及洗脫體積的影響。所有的DNA起始濃度一致，因此洗脫體積越小，產(chǎn)物相對(duì)濃度越高(A)；但是由于磁珠也會(huì)占用一部分洗脫溶液的體積（約1 µL），產(chǎn)物濃度越高則這部分損失越多(B)；雖然小體積洗脫會(huì)得到影響核酸的得率，但是這并不是因?yàn)橄疵撔室鸬模寒?dāng)投入量一致時(shí)，不同洗脫體積的得率無(wú)顯著差異(C)。

洗多久？加熱嗎？

如上圖所示：在1分鐘的時(shí)候，洗脫已經(jīng)進(jìn)入平臺(tái)期（非指數(shù)期）提示大多數(shù)核酸已經(jīng)洗脫下來(lái)。不加熱的情況下，1分鐘與20分鐘洗脫相比，1分鐘的量顯著偏低（p < 0.01)。從2分鐘洗脫開(kāi)始，無(wú)顯著差異。加熱至60度后，洗脫速度更快：1分鐘與其他時(shí)長(zhǎng)無(wú)顯著差異。

小結(jié)

上述實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用lambda phage DNA (49 kb)，對(duì)貝克曼庫(kù)爾特的SPRI技術(shù)磁珠進(jìn)行測(cè)試，提示：

• 長(zhǎng)達(dá)49 kb的核酸片段2分鐘可以被充分洗脫。

• 使用Tris溶液可以提升洗脫效率和穩(wěn)定性。

• 不同的起始及洗脫體積對(duì)洗脫效率影響不大。

• 但是小體積的物理限制會(huì)導(dǎo)致更多核酸損失于死體積。