離心知識大闖關 | 第二期：離心方法介紹

利用樣品中各組分沉降系數(shù)的差異，對不同的微粒施以不同的離心力，經(jīng)過多次離心，離心速度逐步加大，將不同的微粒依次沉降，從而實現(xiàn)離心分離。以不同的離心力分離不同粒徑的微粒是動力學的分離方法。

如果分離樣品中有大中小三種不同粒徑的微粒，對它們施以不同的離心力，大粒徑的微粒，其質(zhì)量較大，首先沉降。分離上清液，以更大轉(zhuǎn)速對上清液進行第二次離心，中顆粒被分離出來。再取上清以更大離心力，更高的轉(zhuǎn)速，最后沉降小顆粒，以達到不同顆粒的分離，如圖1所示。由于在每種顆粒的沉淀物中總含有部分次級顆粒，如想將某種顆粒提純，需對該顆粒的沉淀物進行稀釋后再離心沉淀，最終可制備出理想純度的顆粒。

差速離心主要用于分離直徑和密度差異較大的顆粒和大量樣品的初步分離提純。

實際分離時由于離心時的對流、擴散和收取沉淀時的污染，對于一些沉降系數(shù)相差不大的組分無法進行完全的分離提純，樣品的純度和回收率都不理想。

以動物肝組織勻漿液為例，對勻漿液進行多次的不同相對離心力和時間的離心和沉淀/上清分步收集，就可以得到樣品的細胞核、線粒體、溶酶體和核糖體等的初步分離富集沉淀，用于下一步的其他檢測或者精細純化實驗。具體處理流程如圖2所示。

定義：密度梯度離心是一種借助離心力和液體密度梯度，將顆粒按密度差異進行分離和純化的技術。通過制備自上而下遞增的密度梯度液柱，并在頂部加載樣品，離心時不同密度的顆粒會在與其自身密度相等的液層處形成條帶，從而得以分離。

按照離心分離原理，密度梯度離心又可分為速率區(qū)帶離心和等密度梯度離心。

根據(jù)樣品中不同組分粒子所具有的不同的體積大小和不同的沉降系數(shù)，將混合樣品進行離心分離提純。離心時將需要分離的樣品溶液置于由密度梯度材料，如蔗糖等形成的梯度液柱上面，且樣品粒子的密度必須大于梯度液柱中任一點的密度，否則得不到理想的區(qū)帶離心效果。離心時，混合樣品中不同的組分將在梯度液柱的不同位置分別形成各自的區(qū)帶，選擇適合的轉(zhuǎn)速和時間進行離心，當各組分區(qū)帶距離拉得最遠時，結(jié)束離心，然后將區(qū)帶取出（圖3）。這樣只需通過一次離心就可以把混合樣品中的各組分分離提純，其純度和回收率均可滿足要求。

其最經(jīng)典的應用就是通過蔗糖密度梯度離心，進行各種亞細胞器（核糖體、線粒體、Exosome等）和病毒顆粒（病毒載體、疫苗等）的純化。以70S核糖體沉淀為例，經(jīng)過水解后，可利用蔗糖密度梯度離心，進一步分離純化得到50S和30S的兩個亞基。具體的實驗流程如圖4所示。

等密度梯度離心是根據(jù)樣品中各組分的浮力密度差不同進行分離。在離心力場中，溶液中顆粒浮力密度小則上浮，浮力密度大則下沉，上浮和下沉的顆粒會一直延梯度液移動到與其浮力密度恰好相等的位置上，該位置也稱顆粒的等密度點。

• σ>ρ時，v>0即樣品順離心力方向沉降
  

• σ<ρ時，v<0即樣品逆離心力方向上浮 
  

• σ=ρ時，v=0即樣品停止沉降或上浮，“穩(wěn)定”在這一位置

等密度梯度離心前后樣品的狀態(tài)如圖5所示。因此，在離心前，樣品可置于梯度液的任意位置，一般是均勻分布在梯度液中。

等密度梯度離心經(jīng)常使用的梯度液包括氯化銫(CsCI)、溴化鈉等，典型的應用包括質(zhì)粒 DNA（或者其他DNA、RNA核酸片段）的大規(guī)模高純度純化，脂蛋白的分離純化等（圖6-7）。

在密度梯度離心操作中，梯度介質(zhì)的鋪設是決定分離精度的核心步驟。

常用介質(zhì)必須具備以下特性以確保樣品完整性與實驗重現(xiàn)性：

• 足夠高的溶解度，可形成所需密度

• 低黏度，利于快速沉降

• 化學惰性或低生物毒性，不損傷生物活性

• 易于去除或不影響下游實驗

根據(jù)目標顆粒的沉降系數(shù)或浮力密度，可參考下圖（圖9）選用合適介質(zhì)鋪設連續(xù)梯度液或不連續(xù)梯度液。連續(xù)梯度液密度變化是平滑連續(xù)的，不連續(xù)梯度液密度是分層的、呈階梯式變化（圖10）。因此，連續(xù)梯度用于精細分離大小相近的顆粒（如不同構(gòu)象的DNA），分辨率取決于斜率；不連續(xù)梯度更像篩子，先快速分層，再在階梯界面處“把關”，常用于先粗分、后回收，兼顧速度與通量。

接下來，也給大家介紹幾種較常用的密度梯度液（圖11）。

密度梯度實驗設計考慮要點：

• 梯度類型選擇：連續(xù)梯度（continuous）可獲更高分辨率；不連續(xù)梯度（step）操作更快。

• 轉(zhuǎn)速與時間：需經(jīng)實驗優(yōu)化，避免過度離心導致顆粒聚集或梯度破壞。

• 溫度：4 °C常用于保護生物活性。

• 樣品體積：一般不超過梯度體積的10–20%，以防過載。

• 無菌操作：病毒或細胞實驗需全程無菌。

密度梯度離心以其高分辨率、溫和條件和廣泛適用性，成為細胞和分子生物學研究的核心技術之一。選擇合適的梯度介質(zhì)、優(yōu)化梯度形狀及離心參數(shù)，是實現(xiàn)高效分離的關鍵。我們在此也舉例了比較常用的應用場景（圖12），幫助大家快速選擇。