【闖關贏好禮】流式高手挑戰賽第一期：樣本制備不踩坑！

（具體玩法與規則，請滑至文末查看）

直接洗滌即可，不需消化。

需胰酶/EDTA消化。做凋亡實驗時需要用binding buffer wash 1-2遍，洗去殘留EDTA。做分選時，單細胞懸液需加入DNase防止聚團。

使用EDTA或肝素抗凝，12h內檢測可室溫保存，24-48h處理需4℃保存。

取100-200μl抗凝全血/骨髓，加入2ml紅細胞裂解液，輕柔混勻，外周血室溫孵育裂解10min，骨髓裂解5-8min；特殊樣本可增加稀釋度或延長裂解時間，加入PBS至滿管，300-400g離心5min，棄上清以終止裂解；重復PBS離心洗滌，去除碎片。

骨髓樣本粘稠需用PBS稀釋后再裂解；若紅細胞殘留，可重復裂解1次。推薦使用商品化裂解液，不同品牌以具體說明書為準。

在燈光下觀察，若樣本已呈現透亮狀態，說明基本裂解完成。若采用“先裂后染”的流程，建議在透亮后再額外放置約5分鐘，以確保裂解更徹底。

胞膜表面染色：根據Panel用量加入5-20μl不同熒光素標記的抗體，避光室溫孵育15min，PBS離心洗滌后，重懸于PBS中，若不及時檢測，可加多聚甲醛固定后避光4℃保存，待上機檢測。

胞內染色：按照不同廠家的說明書，先標記膜表面抗體，再添加破膜劑處理10min，后加入胞內抗體，避光室溫孵育30min，洗滌后重懸。

熒光染色過程可以有不同的流程順序：染色-裂解-洗滌，染色-裂解-免洗，裂解-染色-洗滌。不同的染色流程對流式樣本的熒光強度有明顯影響，根據多中心數據表明，染色后裂解繼而洗滌，可以改善FSC、SSC的CV，得到最高的熒光強度。

新鮮組織樣本置于生理鹽水或PBS中，室溫保存，盡量在12h內處理樣本；若無法及時處理，4℃保存，保存時間最好不要超過48h。

剪碎研磨：眼科剪將組織剪成極小塊后注射器針芯研磨成勻漿，PBS混勻后，200-300目濾網過濾，離心去上清，PBS洗滌后調整至所需濃度備用。

網搓：剪碎的組織在300目尼龍網上，邊搓邊PBS沖洗，收集懸液，離心去上清，PBS洗滌后調整至所需濃度備用。

研磨：組織剪成小塊放入組織研磨器加PBS研磨至勻漿，加PBS沖洗后收集懸液再過200-300目尼龍網，離心沉淀去上清，PBS洗滌后調整至所需濃度備用。

蛋白酶消化：組織塊用PBS漂洗后剪成小塊，加入蛋白酶溶液，轉至三角燒瓶于37℃水浴或者恒溫箱中消化一定時間，每隔5-10min震蕩，直至完成消化。消化液經200-300目濾網過濾后離心5min，去上清，PBS洗滌后調整至所需濃度備用。

不同組織樣本根據不同檢測項目要求需選用不同的處理方法。酶處理注意時間、pH值、濃度等影響，且根據組織類型選擇合適的酶。

上皮內淋巴細胞：截取回腸，使用HBSS+FBS+EDTA+DTT+Hepes沖洗，搖床10–15min。

固有層淋巴細胞：使用5% FBS+1.5mg/ml Collagenase VIII+0.1mg/ml DNase in PBS消化30-60min，研磨后用Percoll 40/80%分離。

毛囊干細胞：剃毛取背皮→去脂肪→胰酶消化4℃過夜→37℃ 1h→刮下表皮，過濾。

臍帶間充質干細胞：

1. 物理法：剖開臍帶，抽掉動脈和靜脈，剪成小段，貼壁培養。

2. 消化法：剪碎+膠原酶/透明質酸酶/胰酶/DNase，離心去上清。

四、抗體染色與檢測注意事項

離心：必須用平轉子離心機，防止細胞損傷。

核內vs胞內染色：根據需求選擇透膜劑。

特殊檢測（如pSTAT5等磷酸化蛋白）：可能需混搭固定破膜劑。

抗體用量與細胞數關系不大，主要取決于反應體積。

• 不限時答題：10道單選題，分數相同，用時更短者獲勝。

• 每期TOP1：贏定制版積木。

• 每期TOP2–9：鼠標、隨行杯、折疊太陽傘隨機送出。

• 全員福利：每期參與即有機會抽取蛇年限定公仔20只。

• 同一ID或姓名在每期僅可獲獎一次；如重復獲獎，按最高獎項發放，其余獎品順延。

• 活動結束后15個工作日內聯系獲獎者，請確保個人信息準確完整。收件地址須為單位地址。

下一期將于9月上線

高手們，記得準時來戰！