密度梯度離心機(jī)在試驗(yàn)中應(yīng)該如何進(jìn)行操作？

　　密度梯度離心機(jī)技術(shù)是用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種。密度梯度離心機(jī)技術(shù)常用的介質(zhì)為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖。
 

　　密度梯度離心機(jī)試驗(yàn)操作過程如下：
 

　　1、將收集的組織或臟器或其他,用玻璃勻漿器充分研磨后制成懸液,經(jīng)反復(fù)凍融3 次后,置- 20 ℃冰箱中,備用。
 

　　2、先以5000g離心15分鐘后，獲取上清夜，然后再20000g高速離心30分鐘后取上清夜。
 

　　3、接著10萬g超速離心2h，將沉淀用少量STE溶解。
 

　　4、先在超速離心管中加入5-8mL的第3步所獲取的含病毒樣品的溶解液，然后在離心管中依次加入30 % , 45 % , 60 %的蔗糖,加的時候是用長針頭從底部往上加的。11萬g離心2.5h,發(fā)現(xiàn)在30 %與45 % 以及45 % 與60 %之間都有一條明亮的帶，用長針頭將兩條不同部位的帶都吸取出來，分別收集到不同的瓶內(nèi)。
 

　　5、去蔗糖；用STE緩沖液適量稀釋純化的病毒，然后11萬g離心3h,用少量STE緩沖液把沉淀懸起，即后獲得了純化的病毒。-20度凍純備用，用時可用分光光度計(jì)測定其病毒含量。

　　密度梯度離心機(jī)分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求：
 

　　1、能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時，粘度不高。
 

　　2、PH中性或易調(diào)為中性。
 

　　3、濃度大時滲透壓不大。
 

　　4、對細(xì)胞無毒。區(qū)帶離心法是將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。