【離心課堂】等密度梯度離心法 | 你的分離純化方法選對(duì)了嗎？

離心方法——等密度梯度離心法

等密度梯度離心也稱為平衡密度梯度離心。等密度梯度離心是根據(jù)樣品中各組分的浮力密度差不同進(jìn)行分離。在離心立場(chǎng)中，溶液中顆粒浮力密度小則上浮，浮力密度大則下沉，上浮和下沉的顆粒會(huì)一直延梯度液移動(dòng)到與其浮力密度恰好相等的位置上，該位置也稱顆粒的等密度點(diǎn)，離心時(shí)樣品各組分顆粒將按其密度大小分別移至等密度點(diǎn)形成區(qū)帶，形成的區(qū)帶不會(huì)因離心時(shí)間長(zhǎng)而發(fā)生變化。離心后收集所需區(qū)帶顆粒即為純化組分。離心前后樣品的狀態(tài)如圖1所示。

圖 1 等密度區(qū)帶離心

因此，在離心前，樣品可置于梯度液的任意位置，一般是均勻分布在梯度液中。等密度區(qū)帶離心法的離心效果取決于樣品顆粒的浮力密度差，密度差越大，分離效果越顯著，與樣品顆粒的大小與形狀無(wú)關(guān)。

速率區(qū)帶離心和等密度區(qū)帶離心都需預(yù)準(zhǔn)備梯度液。速率區(qū)帶離心的梯度液密度必須小于待分離組分中小顆粒的浮力密度。利用顆粒形狀和大小差異而形成的沉降速率不同達(dá)到分離目的。等密度區(qū)帶離心是一種平衡離心方法，利用顆粒密度差進(jìn)行分離，與顆粒形狀和大小無(wú)關(guān)，處理量比差速離心法大。

等密度梯度離心經(jīng)常使用的梯度液包括氯化銫(CsCI)、溴化鈉等，典型的應(yīng)用包括質(zhì)粒DNA（或者其他DNA、RNA核酸片段）的大規(guī)模高純度純化，脂蛋白的分離純化等。

質(zhì)粒DNA的氯化銫等密度梯度離心分離純化流程如下：

脂蛋白溴化鈉等密度梯度離心分離純化流程如下：

1、

人全血1000g離心10分鐘去除各種血細(xì)胞，上清為血清。

2、

血清加入NaBr密度梯度液（不連續(xù)梯度）的底部，往上依次鋪濃度變小的梯度液。

3、

然后在水平轉(zhuǎn)頭中，260,000g離心力14℃下離心24小時(shí)，各種密度的脂蛋白從管底浮向它們自己的等密度區(qū)形成了純的各種密度脂蛋白區(qū)。而離心管底部保留著各種血清蛋白。

4、

用上排法從離心管中抽出各層液體，經(jīng)DU核酸蛋白分析儀測(cè)定，定位各種不同密度血清脂蛋白。

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