進化在自然界中每天都在發(fā)生，從未停止，由自然選擇壓力進行篩選，往往需要漫長的時間。近代生物學的發(fā)展使人們認識到蛋白質(zhì)進化大多是由于某些點突變或修飾的積累而形成的。2018年諾貝爾化學獎獲得者弗朗西斯.阿諾德，其*提出了酶的定向進化理論而獲此殊榮。

2018年諾貝爾化學獎得主

蛋白質(zhì)定向進化技術(shù)，被廣泛的應(yīng)用于酶分子改造，以改變酶分子的活性和催化效率，改善底物的選擇性、pH和溫度的耐受性等方面，也可以應(yīng)用于改善代謝途徑、優(yōu)化代謝網(wǎng)絡(luò)等，在蛋白質(zhì)工程、代謝工程和合成生物學領(lǐng)域都發(fā)揮了重要的作用。

蛋白質(zhì)定向進化策略

根據(jù)原理的不同，可以主要分為三種策略，隨機進化、理性進化，和介于兩者之間的半理性進化。這三種方式各有優(yōu)缺點，其中隨機進化的多樣性*，但樣本量巨大，篩選困難，常使用易錯PCR、DNA Shuffling等技術(shù)；理性進化，借助于軟件建模，進行分子對接等模擬實驗，減少了篩選的工作量，但往往得到的蛋白質(zhì)活性不高；半理性進化，根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)進行同源建模，對特定位點進行定點飽和突變的方式，縮小突變文庫，提高陽性突變率。

蛋白質(zhì)定向進化策略及方法^[1]

除了理性設(shè)計突變外，其他兩種進化策略所產(chǎn)生的突變庫都需要大量的篩選工作，依靠人工進行篩選，每天重復性的機械操作讓實驗員感到乏味，巨大的工作量和數(shù)據(jù)量讓項目經(jīng)理感到崩潰，時間和資金的耗費讓老板難以面對。

高通量自動化篩選加速進化過程

想要快速從成千上萬的蛋白質(zhì)中篩選出陽性突變，短時間內(nèi)完成漫長的自然篩選過程，依靠人工篩選，需要耗費大量人力，并且人員之間的操作誤差無法避免，無法實現(xiàn)標準化，導致結(jié)果無法*相互比對，丟失一些陽性突變。

以自動化液體處理工作站為核心的自動化系統(tǒng)，逐漸成為酶定向進化中對突變文庫進行高通量篩選的*。自動化系統(tǒng)可以實現(xiàn)突變文庫篩選的自動化、高效化、標準化，提高實驗通量及效率，縮短酶定向進化過程的篩選周期。

以大腸桿菌為表達宿主，隨機進化的策略進行酶定向進化為例。

以大腸桿菌為宿主的酶定向進化流程示意圖

在上述流程中，主要以自動化液體處理工作站為核心，進行大量的液體處理，整合克隆挑選機器人解決人工挑選的限速步驟，以及培養(yǎng)箱、酶標儀、離心機、封膜機、撕膜機等設(shè)備，協(xié)同配合自動化完成整個流程。

Biomek i7自動化液體處理工作站及Qpix系列高通量微生物克隆篩選系統(tǒng)

隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，流式細胞技術(shù)也被應(yīng)用于突變文庫的篩選之中，利用分選型流式細胞儀進行突變文庫的初篩，不僅通量高、速度快，還可以根據(jù)熒光信號強度將細胞分選至96孔板、384孔板甚至是1536孔板中，進行培養(yǎng)和第二輪篩選。

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*本文涉及的內(nèi)容與產(chǎn)品僅用于科研和工業(yè)，不用于臨床診斷。

參考文獻：

王曉玥, 王白云, 王智文, 陳濤, 趙學明等. 蛋白質(zhì)定向進化的研究進展. 生物化學與生物物理進展. 2015, 42(2): 123-131.

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